Для чего нужны светофильтры для микроскопа

Обновлено: 16.05.2024

Человеческий глаз может различать объекты, если они отличаются от фона яркостью, цветом, насыщенностью, удалённостью и тому подобным. Оптический контраст прямо пропорционален разности яркости объекта наблюдения и фона, и обратно пропорционален яркости объекта наблюдения: K (контрастность) = (B1-B2)/B1. Для контрастирования могут использоваться различные фильтры, пластинки с прорезями, линзы и зеркала, устанавливающиеся в оптическом канале. Эти элементы: отсекают определённую область спектра электромагнитного излучения, задерживают ход лучей, изменяют угол падения светового пучка, собирают или рассеивают лучи света.

Рис. 1. Принцип освещения по Кѐллеру. 1 – источник света, 1а – изображение источника света, 2 – коллектор, 3 – полевая диафрагма осветителя, 3а – изображение полевой диафрагмы, 4 – светофильтр, 5 – апертурная диафрагма, 6 – конденсор, 7 – препарат, 8 – объектив микроскопа

Тёмное поле – это метод контрастирования, при котором образец освещается полым конусом света, который рассеивается от образца и формирует изображение. Метод был разработан Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 году и подходит только для объектов минимально отражающими и поглощающими свет, то есть, предназначен для микроскопирования прозрачных объектов.

Рис. 2. Освещение препарата в методе темного поля в отражённом свете.

Темнопольные объективы (рисунок 2, слева) для исследований в отражённом свете кардинально отличаются от светлопольных: от осветителя свет проходит через диафрагму (это исключает засветку по центру) по каналам в стенке объектива и падают на образец по касательной под таким углом, чтобы рассеиваться от неровностей и не попадать в оптический канал объектива. То есть ровную поверхность мы не видим (так как она не рассеивает свет) – это тёмная область в поле зрения, а все неровности – светлые. Для этого метода исследования используются темнопольные микроскопы Olympus BX43 и BX53M.

Из особенностей этого метода надо отметить, что, если у объективов будет слишком высокая апертура, а значит и большой угол конуса раскрытия света, то часть света не рассеется от образца, а отразится от поверхности и попадёт в объектив. Для того, чтобы этого избежать, в темнопольных объективах установлена ирисовая диафрагма, которую вы можете видеть, например, в объективах с большим увеличением UPLFLN100XOI2/1.3.

Рис. 3. Трепонема в тёмном поле.

Фазовый контраст – это метод преобразования сдвига фаз в изменения амплитуды световой волны, то есть, яркости. Фазовые изменения, которые зависят от толщины, состава, геометрии и т.д. возникают из-за различных показателей преломления в прозрачных объектах, а, следовательно, разности ходов лучей.

Рис. 4. Клетка в фазовом контрасте.

Метод фазового контраста был разработан в 1934 году Ф. Цернике, который через 19 лет получил мировое признание и стал лауреатом Нобелевской премии в области физики. С помощью этого метода впервые стало возможно наблюдать структуру неокрашенных клеток. Диаметр клетки без ядра может быть меньше 1 мкм и не обладать свойствами поглощения видимой области светового спектра, что затрудняет её наблюдения по методам светлого и тёмного поля.

Рис. 5. Устройство фазового контраста.

Фазовый контраст основан на том, что сдвиг фазы лучей, проходящих через биологические объекты, примерно равен (90°). Чтобы понять область применения метода, объясним, как он работает.

Когда световые волны проходят через среду, отличную от вакуума, взаимодействие со средой приводит к изменению амплитуды и фазы волны в зависимости от свойств среды. Изменения амплитуды (яркости) возникают из-за рассеяния и поглощения света, который часто зависит от длины волны и может приводить к появлению цветов.

Обратите внимание на график, есть две оси: амплитуда и время. Нам сейчас интересно смещение волн по оси времени, без изменения фазы. Проходя через клетки, фаза смещается, примерно, на четверть от первоначальной длины волны. Теперь посмотрите на рисунок 5. Проходя через кольцевую диафрагму, свет падает полым конусом на объект, проходит через него, разделяется на два луча: один луч (полая воронка света, фоновый свет) попадает в объектив, не преломляясь от клетки и проходит через фазовую пластинку, на которой, в канавке между центром и краем, нанесен специальный материал, задерживающий свет на -90° (тогда это отрицательный фазовый контраст) либо наоборот сдвигающий на +90° (положительный фазовый контраст); второй луч преломляется, рассеивается (становится дифрагированным) в фазовом объекте (клетки, маленькие кристаллы и т.д.) и тоже приобретает сдвиг по фазе.

Рис. 6. Фазовые пластинки.

Фоновый свет, пройдя через канавку в фазовом кольце, распределится более-менее равномерно во всём поле зрения и произойдёт интерференция когерентного света (ведь свет, замедленный при прохождении через клетку, находится в той же фазе). Таким образом Вы видите увеличение амплитуды там, где фоновый свет, накладывается на дифрагированный.

Такой метод подойдёт только для тонких объектов, потому что длина волны видимого света мала, и чтобы хорошо видеть сдвиг, необходимо, чтобы объект смещал его примерно на 90°. Через напыление в канавке фазового кольцо проходят не только фоновые волны, но и дифрагированные волны смещаются по фазе, однако они не интерферируют и не искажают картину.

Качественный фазовый контраст легко настроить на микроскопах Olympus CX43, BX53, CKX53 и IX53. Настраивая фазовый контраст, необходимо совместить кольцо света, прошедшего через фазовую пластинку конденсора, с фазовым кольцом объектива.

Поляризационный контраст – это оптический метод обнаружения, определения свойств и строения анизотропных объектов по характеру их двулучепреломления и цвету.

Явление поляризации света при отражении открыл Этьен Луи Малюс в 1808 году, а двумя годами позже предложил метод определения оптической оси кристалла. Не менее важный вклад внёс Дэвид брюстер, открыв 1815 двулучепреломление в средах с искусственной анизотропии и круговую поляризацию.

Открытие поляризации дало возможность исследователям наблюдать поведение света при прохождении через кристаллы. Например, если просматривать текст через исландский шпат CaCO₃, то вы увидите, как текст двоится (см. рисунок 7).

Рис. 7. Двойное лучепреломление.

Рис. 8. Оптическая ось кристалла.

Флуорофор – это молекула или часть молекулы, способная флуоресцировать. При попадании излучения, частота которого соответствует частоте возбуждения, молекула переходит из основного состояния в возбужденное. Однако возбужденное состояние неустойчиво, через некоторое время (обычно 10 -15 - 10 -9 с) произойдет испускание фотона, и молекула вернется на более низкий энергетический уровень. Из-за вибрационных, тепловых и звуковых потерь энергии длина волны этого излучения будет больше, чем длина волны поглощенного света.

Один флуорофор может непрерывно возбуждаться, если он не разрушен, то есть пока не произошло фотообесцвечивания - необратимого разрушения флуорофора из-за химического повреждения или ковалентной модификации, вызванной излучением. Среднее число циклов возбуждения и эмиссии, которое может пройти конкретный флуорофор до фотообесцвечивания, зависит от его молекулярной структуры и окружающей среды; некоторые флуорофоры разрушаются быстро, после испускания всего нескольких фотонов, в то время как другие могут пройти цикл по тысяче и даже миллиону раз.

Фильтры для флуоресцентного микроскопа

Экспериментальная установка содержит фильтры, часто используемые в эпифлуоресцентной микроскопии – это вид микроскопии, в которой возбуждающее и эмиссионное излучение проходят через объектив микроскопа. Путем тщательного выбора соответствующих фильтров и зеркал можно увеличивать соотношение сигнал-шум. Как видно из схемы, три типа фильтров используются для максимизации сигнала флуоресценции и минимизируют при этом нежелательное излучение. Каждый оптический элемент подробно описан далее.\

Рисунок 1. Схема хода луча в флуоресцентном микроскопе. To image – формирование изображения. Fluorescence – флуоресценция. Filter cube – фильтрующий блок. Emission filter – эмиссионный фильтр. Excitation filter – возбуждающий фильтр. Dichroic mirror – дихроичное зеркало. Objective - объектив. Sample plane – плоскость образца

Фильтр возбуждения

Возбуждающий фильтр пропускает узкий диапазон длин волн вокруг пиковой длины волны возбуждения флуорофора. По графику видно, что полоса пропускания, соответствующая передаче более 90% сигнала при прохождении сквозь фильтр возбуждения желтого флуоресцентного белка (YF) (MF497-16), составляет 489-505 нм; падающее излучение вне этого диапазона либо частично (для областей вблизи области передачи), либо полностью (для отдаленных областей) блокируется.

Дихроичное зеркало

Дихроичные зеркала предназначены для отражения света, длина волны которого ниже определенного значения – длины волны отсечки. В микроскопе дихроичное зеркало направляет нужный диапазон длин волн как на образец, так и на плоскость изображения. Длина волны отсечки соответствует 50% -ной передаче сигнала. Как показано на графике справа, длина волны отсечки дихроичного зеркала (MD515) для желтого флуоресцентного белка (YFP) составляет ~ 515 нм.

Поместив одно из этих зеркал в экспериментальную установку под углом 45 ° к падающему пучку, излучение возбуждения (обозначено синим цветом) отражается от поверхности дихроичного зеркала и попадает на образец, проходя через объектив микроскопа, в то время как флуоресценция, излучаемая образцом (красный цвет на схеме), проходит через зеркало к системе обнаружения.

Хотя дихроичные зеркала выполняют важные функции в флуоресцентной микроскопии, у этих приборов есть некоторые недостатки. Речь идет о блокировании нежелательного света; как правило, ~ 90% света на длинах волн ниже значения длины волны отсечки отражаются и ~ 90% света на длинах волн выше этого значения зеркало пропустит. Следовательно, часть излучения возбуждения может передаваться через дихроичное зеркало вместе с флуоресценцией большей длины волны, испускаемой образцом. Чтобы предотвратить попадание этого нежелательного света в систему обнаружения, помимо дихроичного зеркала используется фильтр излучения.

Рисунок 2. График пропускания набора фильтров. Обратите внимание, что дихроичное зеркало (зеленый) отражает свет в диапазоне длин волн возбуждения (синий) и передает сигнал в диапазоне длин волн излучения (зеленый)

Эмиссионный фильтр

Эмиссионный фильтр служит для того, чтобы блокировать нежелательное излучение. Подобно фильтру возбуждения, этот фильтр пропускает определенную полосу длин волн вокруг пиковой длины волны излучения флуорофора. Как показано на графике справа, полоса пропускания эмиссионного фильтра(MF535-22), соответствующая передаче более 90% сигнала от желтого флуоресцентного белка (YF) составляет 524 - 546 нм; падающее излучение вне этого диапазона либо частично (для областей вблизи области передачи), либо полностью (для областей, удаленных от полосы пропускания) блокируется фильтром.

Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности по продукции Thorlabs на территории РФ

Главная /
Центр клиентской поддержки /
Часто задаваемые вопросы о микроскопах

На сайте Meiji Techno вы также можете скачать руководства по эксплуатации, каталоги и брошюры изделий, нажмите здесь.

Сложный микроскоп имеет один оптический путь, разделяемый в окуляре на идентичные изображения слева и справа. Стерео микроскоп можно представить, как два сложных микроскопа, стоящих на расстоянии, имитирующем расстояние между глазами. Это расстояние обеспечивает пространственное зрение в обычной жизни и объемное и неперевернутое изображение в стереомикроскопах.

Разрешающая сила характеризует способность объектива четко разграничивать две близких друг к другу точки или линии. Чем короче расстояние между точками или линиями, тем больше разрешающая сила. Также чем выше значение Ч.А. (числовой апертуры) объектива, тем больше его разрешающая сила. Разрешение — это способностью различать две точки как две точки. Для получения необходимого качества изображения следует соблюдать баланс между разрешающей силой и разрешением.

Чем выше значение числовой апертуры для конкретного увеличения, тем ярче изображение. Чем больше увеличение, тем меньше яркость изображения.

Расстояние между ближней и дальней границами объекта, которые выглядят достаточно четко при рассмотрении с помощью оптического инструмента. Глубина резкости зависит от объективов, окуляров и увеличения трубки. Чем выше увеличение, тем меньше глубина резкости.

Диоптрическая коррекция — это компенсация дальнозоркости или близорукости зрения пользователя.

Лучи света от всех точек поля зрения собираются в одной точке, где должен располагаться глаз пользователя.

Это диаметр линзы окуляра, выраженный в миллиметрах.

Поле зрения — это часть наблюдаемого объекта, которую можно видеть с помощью определенной комбинации оптики. Представляет собой круглую область, наблюдаемую в микроскопе. Поле зрения оптического прибора зависит от его увеличения — чем выше увеличение, тем меньше поле зрения. В большинстве случаев показатель величины поля окуляров можно использовать для расчета размера поля зрения, используя следующую формулу:

Размер поля = Величина поля ÷ Увеличение объектива

Это расстояние между центрами зрачков ваших глаз.

Если стереомикроскоп "парфокален", препарат можно рассматривать с минимальным и максимальным увеличением без дополнительной фокусировки.

Рабочее расстояние — это расстояние между объектом (плоскостью покровного стекла) и нижним краем оправы объектива.

Рабочее расстояние уменьшается при использовании объектива с большим увеличением.

Для расчета общего увеличения конкретной конфигурации микроскопа увеличение объектива умножается на увеличение окуляра и на увеличение дополнительных линз при их наличии.

Полезное увеличение находится в области 500-1000-кратной величины апертуры объектива. Поскольку разрешающая способность человеческого глаза ограничена, следует выбирать такое увеличение, при котором глаз сможет различать детали изображения. При меньшем увеличении человеческий глаз не сможет различать детали изображения. Если увеличение превышает данный диапазон, то его называют "пустым увеличением", так как разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать разрешающую способность глаза. При этом изображение выглядит расфокусированным.

Разрешающая способность линзы объектива зависит от ее числовой апертуры, которая в свою очередь зависит от показателя преломления среды между препаратом и линзой объектива. Чем выше показатель преломления, тем больше света может собрать линза и тем выше будет яркость получаемого изображения. Воздушная среда имеет относительно низкий показатель преломления, в ней лучше всего работают объективы с малой Ч.А. Объективам с более большей Ч.А. требуется больший показатель преломления, который обеспечивается иммерсионным маслом. Для получения оптимальных результатов необходимо также нанести масло на верхнюю линзу конденсора. Иммерсионные объективы имеют маркировку "oil" или "oel". Объективам с маркировкой "wi" в качестве иммерсионной среды требуется вода.

Для сохранения темноты фона в темнопольной микроскопии объектив не должен иметь Ч.А. больше минимальной Ч.А., указанной на темнопольном конденсоре. Ирисовая диафрагма позволяет уменьшить Ч.А. объектива и, соответственно, использовать объективы в большей Ч.А. для темнопольной микроскопии. Объективам с Ч.А. выше 1,2 требуется ирисовая диафрагма для темнопольной микроскопии. Для светлопольной микроскопии диафрагма может просто оставаться полностью открытой.

В большинстве случаев при исследовании проходящим светом вам понадобится только темнопольная вставка для конденсора. При работе c большими увеличениями вам понадобится объектив с ирисовой диафрагмой и темнопольный конденсор.

Пометка "0.17" означает толщину (мм) покровного стекла, которое учитывалось производителем при вычислении коррекций для данного объектива. При использовании объективов с числовой апертурой выше 0,45 несоблюдение данного показателя (или вообще отсутствие покровного стекла) может привести к неудовлетворительному качеству изображения.

"160" означает длину тубуса микроскопа, 160 мм соответствует расстоянию от края револьверного устройства (куда вкручивается объектив) до верхнего среза окулярной трубки (куда вставляется окуляр). Удлинение этого расстояния посредством добавления принадлежностей в световой путь над револьвером приведет к появлению сферических аберраций при отсутствии соответствующей оптической коррекции у данных принадлежностей.

Объектив, скорректированный на бесконечность, формирует параллельные лучи света, спроецированные в бесконечность. Такому объективу требуется тубусная линза, фокусирующая параллельные лучи в диафрагму окуляра.

Планобъектив проецирует плоское изображение всего поля зрения.

Это стандартное обозначение для большинства изготовителей, позволяющее легко определить увеличение объектива:

A red ring means 4X or 5X.
A yellow ring means 10X.
A green ring means 20X.
A blue ring means 40X, 50X or 60X.
A white ring means 100X.

Эти буквы обозначают большое и ультра-большое рабочее расстояние объектива, значительно превышающее показатели стандартных объективов со схожим увеличением.

Этими буквами обозначаются объективы, разработанные специально для микроскопии Номарского или дифференциальная интерференционно-контрастной микроскопия. На текущий момент компания Meiji не предлагает подобных объективов.

Такие объективы имеют очень короткое рабочее расстояние. При легком контакте линзы с препаратом или столиком механизм спружинит и предотвратит повреждение оптики или препарата.

Возможно, покровное стекло препарата толще стандартных 0,17 мм, или сам слайд толще обычного. Для улучшения качества изображения попробуйте использовать сухой объектив с коррекционным кольцом или иммерсионные объективы с увеличением 40х или 50х, поскольку иммерсионные объективы менее чувствительны к толщине покровного стекла.

Да. Просто переведите фазовый конденсор в светлопольный режим и используйте стандартную процедуру освещения по Келлеру.

Могу ли я использовать объектив, скорректированный на бесконечность, на микроскопе с конечной длиной тубуса?

Нет, поскольку в конечной системе нет тубусной линзы для фокусировки параллельных лучей.

Объективы для микроскопов не оснащены средствами коррекции латеральной хроматической аберрации и требуют компенсационный окуляр (с пометкой "С" или "К"). "WF" обозначает широкопольный окуляр и позволяет рассматривать большую часть препарата. "H" означает высокий вынос зрачка, т.е. для изучения препарата вам не нужно подносить глаза близко к окулярам. В основном, такие окуляры предназначены для тех, кто носит очки, но их может использовать любой.

Фотоокуляры используются для фотомикроскопии. Они захватывают изображение в объективе и переносят его на пленку в камере. Фотоокуляры обычно имеют малое увеличение, чтобы снизить вероятность получения пустого увеличение при переносе изображения на пленку.

Почему я не могу использовать окуляры с все большим увеличением для получения более высокого общего увеличения?

Для поддержания полезного увеличения с удовлетворительной четкостью и разрешением следует избегать пустого увеличения или увеличения размера препарата, но не его четкости. Как правило, общее увеличение не должно превышать 750-1000-кратной величины апертуры объектива. К примеру, при увеличении 40Х и Ч.А. 0,65, общее увеличение должно быть между 480X и 650X.

Фильтр нейтральной плотности равномерно поглощает свет по всей области видимого спектра, снижая интенсивность света без изменения его цветовой температуры.

"Фильтр" дневного света поглощает часть желтого и красного света от лампы микроскопа, что позволяет получить добиться эффекта дневного света, более комфортного для глаз.

Фильтр дневного света предназначен исключительно для наблюдения. Не используйте этот фильтр для микрофотографии или с кинопленкой для дневного света.

Человеческий глаз видит зеленый цвет лучше всего. А поскольку монохромный свет устраняет хроматические аберрации, зеленый фильтр заметно улучшает эффективность ахроматических объективов. Кроме того, в зеленом свете фазово-контрастные объективы выдают наилучшее изображение.

Объективы скорректированы для исправления кривизны поля изображения и цветовой аберрации. Разница между ахроматами и планахроматами заключается в степени плоскости поля. Когда изображение сфокусировано от центра к краям, поле изображение считается "плоским". Чем выше степень исправления кривизны поля, тем больше линз установлено в объективе и тем он дороже.

"DIN" — аббревиатура от "Deutsche Industrial Normen". Это немецкий стандарт, принятый в качестве международного оптического стандарта и применяемый в большинстве микроскопов. Длина тубуса у объектива стандарта DIN составляет 160 мм. Ранее использовался стандарт RMS, согласно которому длина тубуса была 170 мм. Большая часть оптических устройств DIN взаимозаменяемы. Однако объективы DIN и RMS не являются взаимозаменяемыми.

Обычно эта цифра выгравирована на окуляре и обозначает физический диаметр полевой диафрагмы. Значение "FN" определяет величину поля зрения для конкретного окуляра.

Правильное освещение играет ключевую роль для получения качественного изображения в любом микроскопе. Компания Meiji Techno предлагает несколько вариантов освещения на выбор. Мы можем подобрать нужное освещение для любого вашего препарата, чтобы обеспечить наилучшее изображение.

Лампа накаливания — Стандартная нить накала, обычно 6 - 120V, 20 - 60W. Цветовая температура "теплая", оттенок ближе к желтому.
Галогенное — Низкое напряжение, более интенсивное освещение. Температура идеальна для цветной фотографии.
Флуоресцентное — "Холодная" система, производящая больше света и имеющая больший срок службы по сравнению с лампами накаливания. Флуоресцентные источники света предлагают более подходящую цветовую температуру (4100º Кельвина) и белое поле зрения более комфортное для глаз.

Коаксиальным называется движение совпадающих осей или шестерней с общей осью. При коаксиальном управлении градуированным предметным столиком одна из рукояток управляет движением по оси "Х", а другая — по оси "Y". В коаксиальной системе фокусировки винт тонкой настройки находится внутри винта грубой фокусировки.

Темнопольная микроскопия — это метод исследований, при котором препарат (прозрачный или полупрозрачный) представляется как яркий объект на темным (обычно черном) фоне.

Светлопольная микроскопия — это наиболее распространенный тип микроскопии, используемый в сферах обучения, промышленности и медицины. При работе с этим методом прозрачный или полупрозрачный препарат (окрашенный или неокрашенный) представляется как темный объект на светлом фоне или поле.

Методика для выявления структурных особенностей микроскопических прозрачных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. Этот метод позволяет добиться того же эффекта, что и при окраске препарата (из-за чего живые клетки могут погибнуть).

Масляная иммерсия используется для объективов с большим увеличением (обычно 100Х) в качестве среды между линзой и покровным стеклом. Масло обладает тем же показателем преломления, что и стекло. Также требуется конденсор Аббе с Ч.А. 1,25.

Механический столик можно подсоединить к большинству моделей микроскопов Meiji.

Да. Видеокамеры с типом крепления C-Mount можно использовать с большинством моделей микроскопов Meiji.

Да, с помощью универсального адаптера и крепления T-Mount, соответствующего вашей модели и марке камеры.

На данный момент мы продаем цифровые камеры. Однако мы выпускаем адаптеры, которые подходят для многих моделей камер, доступных на рынке. Вы можете ознакомиться с ними здесь.

Грязь, царапины и повреждения объектива негативно влияют на качество изображение. "Черный точки" указывают на наличие частиц грязи в окуляре, на призме или зеркалах. Ниже представлены советы по устранению этих загрязнений:

Переднюю линзу объектива (в особенности 40Х) сперва следует очистить от частиц пыли с помощью щетки из верблюжьей шерсти, затем бережно протереть мягкой протирочной тканью, смоченной ксилоном или чистой дистиллированной водой, и сразу высушить с помощью чистой бумаги для протирки оптических стекол. Разбирать объектив должен квалифицированный специалист по ремонту. Для удаления пыли с задней линзы микроскопа используйте резиновую спринцовку.

Окуляры можно очищать тем же способом, что и объективы, но в большинстве случае ксилон не потребуется. Достаточным просто подышать на линзу, а затем протереть ее чистой протирочной тканью.

Внешнее покрытие микроскопов Meiji выполнено из твердого эпоксидного состава, устойчивого к кислотам и реагентам. Для очистки этих поверхностей используйте ткань и мягкодействующее моющее средство.

Примечание: Если загрязнение сильное, то можно воспользоваться этиловым спиртом. Ксилон или ацетон следует применять лишь в крайних случаях. Использование этих средств приведет к повреждению покрытия линз.

Компания Meiji Techno не несет ответственности и освобождается от возможных претензий за любые ошибки, допущенные во всех опубликованных и неопубликованных документах, за любые повреждения изделий, возникших в результате действий конечных потребителей, сотрудников Meiji Techno, их дистрибьюторов и поставщиков при применении оборудования и документов, имеющих отношение к их использованию, ремонту и обслуживанию.

Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом.

Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса). При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.

Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от микроскопа проходящего света следующим:
• Наличие мощного источника света в осветителе, изучающего преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогенная кварцевая лампа).

Оптика объективов люминесцентного микроскопа изготавливается из нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. При работе с объективами масляной иммерсии используется нелюминесцирующее иммерсионное масло.

Поскольку большинство микроорганизмов не обладают собственной люминесценцией, существует несколько способов их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе. Прежде всего это флюорохромирование - окрашивание сильно разведенными (до нескольких микрограмм/мл) растворами флюоресцирующих красителей (флюорохромов). Этот метод используется для бактериоскопического исследования возбудителей некоторых инфекций: туберкулеза (ауромин),, включений в клетках, образуемых некоторыми вирусами и др. Этот же способ может применяться для цитохимического изучения живых и фиксированных микроорганизмов: некоторые флюорохромы избирательно связываются с полимерами клетки (акридиновый оранжевый связываясь с ДНК флюоресцирует зеленым, а с РНК - красным.
В реакции иммуннофлюоресценции с помощью антител, меченных флюорохромами (ФИТЦ и др.), выявляются антигены микроорганизмов или антитела в сыворотке больных.

Во флуоресцентной микроскопии используются два способа освещения препарата: проходящим светом и падающим, светом.

Освещение проходящим светом

Конденсор фокусирует возбуждающий свет в поле зрения микроскопа. Испускаемая флуоресценция собирается объективом и наблюдается с помощью окуляров. При такой конфигурации прибора достаточно двух линз: с помощью одной (конденсор) фокусируется возбуждающий свет, с помощью другой (объектив) собирается испускаемый свет. Для получения оптимальных условий наблюдения две эти линзы, имеющие собственные оптические оси, должны быть хорошо отъюстированы. Достичь точной юстировки и затем поддерживать ее при постоянной работе не так просто.

Недостатком освещения проходящим светом является то, что при освещении светлопольным конденсором практически весь возбуждающий свет попадает в объектив. Поскольку интенсивность возбуждающего света часто на несколько порядков выше интенсивности света флуоресценции, то для их разделения требуются фильтры очень высокого качества. Чтобы избежать этой проблемы, можно воспользоваться темнопольным конденсором, который освещает препарат под таким углом, что никакой прямой возбуждающий свет не попадает в объектив. Это содействует разделению возбуждающего света и света флуоресценции, которое в основном производится с помощью запирающих светофильтров. Но, с другой стороны, темнопольные конденсоры пропускают намного меньше возбуждающего света, чем светлопольные конденсоры. В случае применения проходящего света в сочетании с объективами большой оптической силы требуется помещать между конденсором и предметным стеклом иммерсионное масло, что также создает неудобства при постоянной работе. Недостатком освещения проходящим светом является и то, что трудно совмещать флуоресценцию с фазовым контрастом или светлопольной микроскопией.

Освещение падающим светом

Для фокусировки возбуждающего света на препарат и собирания испускаемого флуоресцирующим препаратом света используется только одна линза — объектив. Для отделения испускаемого света флуоресценции от непоглощенного возбуждающего света используется зеркало специального типа — цветное светоделительное зеркало (дихроичное зеркало), которое располагается при флуоресцентной микроскопии на пути падающего света над объективом. Эти зеркала имеют специальное интерференционное покрытие, которое отражает на препарат свет, длина волны которого меньше определенного значения, и пропускает более длинноволновый свет флуоресценции в окуляры. Более того, возбуждающий свет, отраженный от препарата или от оптических деталей микроскопа и идущий в окуляры, эффективно отражается дихроичным зеркалом и не попадает, таким образом, в окуляры. Таким образом, цветное светоделительное зеркало работает и как возбуждающий, и как запирающий фильтр, но на практике нужен дополнительный запирающий фильтр для того, чтобы удалить остатки возбуждающего света.

Преимуществом зпиосвещения является то, что одна и та же система работает и как конденсор, и как объектив. Таким образом, фокусируя данный объектив на препарате, вы одновременно получаете правильную настройку всей данной части микроскопа. Освещаемое поле является полем зрения. При использовании масляно-иммерсионного объектива достаточно нанести масло на препарат, тогда как при работе в проходящем свете для получения максимальной интенсивности освещения необходимо еще нанести масло на высокоапертурный конденсор. Кроме того, эпиосвещение позволяет легко переходить от флуоресцентной микроскопии к микроскопии в проходящем свете, так как нижнее освещение остается легкодоступным. Последнее обстоятельство в ряде случаев имеет большое значение, например при использовании иммунофлуоресценции в сочетании с фазово-контрастной микроскопией.

Как в любом другом виде микроскопа, в стоматологических оптических приборах под конденсором имеется держатель для светофильтров. Качественные светофильтры изготавливаются из стекла. Они могут быть матовыми, нейтральными или цветными.

Светофильтр вводится в оптический ход лучей в том случае, когда необходимо защитить глаза от лазерного излучения, изменить яркость освещения рабочей зоны или выделить (подавить) определенную часть спектра.

Синие фильтры чаще всего используются в сочетании с галогеновыми осветителями. В этом случае получается освещение, приближенное к дневному, поэтому глаза у врача устают медленнее.
Оранжевые светофильтры применяют во время лечебного процесса, чтобы замедлить процесс полимеризации пломбировочных материалов. Включать такой светофильтр имеет смысл уже на этапе нанесения адгезива.
Зеленый светофильтр используют при оперативных вмешательствах в полости рта. При этом устраняется красный цвет, что позволяет лучше визуализировать собственно зуб и сосуды вокруг него.
Лазерный светофильтр используют для защиты глаз от лазерного излучения во время лечебного процесса с одновременным использованием лазера и микроскопа. Этот фильтр может защищать от рассеянного и отраженного лазерного излучения в диапазоне 780нм - 2940нм, т.е. фактически от всех лазеров, которые сейчас используются для медицинских целей.

И напоследок следует сказать, что светофильтры стоит использовать при действительной необходимости. Ведь любой добавочный элемент, введенный в оптическую систему, забирает лучи света, а, значит, создает недостаточно яркое освещение рабочей зоны.

Большинство бактерий имеет крайне малые размеры, что делает невозможным их изучение без микроскопа. Однако и среди них есть свои гиганты, и карлики.

Ветеринария - это наука, которая занимается профилактикой и лечением травм и болезней животных, а также защитой человека от заражений общими для них инвазионными (возбуждаемыми животными паразитами) и инфекционными болезнями.

Читайте также: